De kwaliteit van corona virus testen

Over de kwaliteit van corona-testen wordt de laatste dagen veel gesproken en veel geschreven. Hierbij worden moeilijke termen gebruikt zoals sensitiviteit, specificiteit en betrouwbaarheid en daar worden percentages bij genoemd, waarbij in het algemeen wordt verteld ‘hoe hoger het getal hoe beter de test’. Ik zal u proberen uit te leggen dat het vaststellen van de sensitiviteit van een test vaak moeilijk (of zelfs soms onmogelijk) is. De sensitiviteit is niet zozeer afhankelijk van de kwaliteit van een test, maar meer afhankelijk van de ziektestatus van de persoon waarbij de test wordt gebruikt. Door een 'slimme' selectie te maken van de onderzoeksgroep kunnen we alle getallen produceren voor sensitiviteit tussen 0 en 100 %. De ‘deskundigen’ zullen dit in de media naar eigen inzicht en/of eigen belang kunnen gebruiken.

Wat willen we meten met een test?

De allerbelangrijkste vraag is: waar is de test voor bedoeld en wat beoogt deze te meten? Voor laboratorium onderzoek naar COVID-19 zijn er globaal twee soorten testen:

1. Testen die als doel hebben om het virus aan te tonen en vast te stellen of iemand op dit moment besmet is met het virus.
   Hiervoor kan in een monster (speeksel, slijm uit wang of keel, ontlasting, bloed) het virus-RNA of specifiek virus-eiwitten (ook wel virus antigenen genoemd) worden gemeten. Indien positief dan kan er eventueel nog een vervolg onderzoek gedaan worden om de diagnose COVID-19 definitief vast te stellen, bijvoorbeeld een CT scan van de longen (deze test in combinatie met het klinisch beeld worden als gouden standaard gezien)
2. Testen die als doel hebben om de immuun-status tegen het virus aan te tonen bij mensen die de ziekte (al dan niet bewust) hebben doorgemaakt.
   Hiervoor kunnen in een monster (bijna altijd bloed) antistoffen tegen het corona-virus worden aangetoond. Dit zijn corona specifieke IgM en IgG antistoffen. Indien positief dan wordt aangenomen dat betreffende individu een corona-virus infectie heeft doorgemaakt en immuniteit heeft opgebouwd. Of dit voldoende is om geen volgende infectie meer te kunnen krijgen kan deze test niet met zekerheid zeggen, maar hieronder geef ik daar nog wel wat suggesties voor. Er bestaat geen vervolg onderzoek met een andere methode om definitief vast te stellen of iemand de ziekte daadwerkelijk heeft doorgemaakt (er bestaat dus geen gouden standaard).
    

Testen om de ziekte COVID-19 aan te tonen

Zoals hierboven al genoemd worden hier meestal RNA of antigeen testen voor gebruikt. Het aantonen van virus specifiek RNA (het genetisch materiaal van het virus met PCR methode) of van virus-specifiek antigeen of eiwit (met een sandwich Elisa methode) zijn dusdanig specifiek dat een positieve test in de regel bewijzend is voor een corona infectie. Deze testen hebben een zeer hoge mate van specificiteit. Het probleem is echter de monstername. Als er bijvoorbeeld wangslijm wordt afgenomen waar toevallig geen of zeer weinig virusdeeltjes meer inzitten (bij geringe klachten is het aantal virusdeeltjes vaak laag en/of verhuist het virus vrij snel van het mond- en keelgebied naar de longen; bij ernstige klachten blijft het veel langer aantoonbaar in het wangslijm of keelslijm) dan is een RNA of antigeen test negatief. Maar omdat het virus zich wel in de longen bevindt is er wel degelijk sprake van een corona infectie. In dit geval spreken we van een foutief negatieve test (in Engels False Negative afgekort met  FN). We zouden ook kunnen zeggen dat de gevoeligheid van de test te laag is om de ziekte COVID-19 in alle gevallen op te sporen; de sensitiviteit van de test is laag (eigenlijk is de test niet te ongevoelig, maar is de keuze van het monstermateriaal niet goed). Dit is de oorzaak dat corona-virus RNA en antigeen testen een beperkte sensitiviteit hebben. Door bij mensen met hoge verdenking vaker te testen neemt de kans op een positieve uitslag toe. Er zijn aanwijzingen dat ongeveer 30 % van de mensen met COVID-19 foutief negatief worden getest met deze (specifieke) RNA en antigeen testen op afgenomen wangslijm. Bij monsters afgenomen met een keelswab lijkt dit percentage fout negatief lager te zijn. De sensitiviteit (van de initiële test) is in dit geval ongeveer 70 % en volgens sommige studies zelfs nog lager.

Nu moeten we ons verder verdiepen in de begrippen specificiteit en sensitiviteit

De sensitiviteit van een test is het percentage correct positieve testresultaten (in Engels True Positive afgekort met TP) in een groep mensen met bewezen ziekte (met zekerheid vastgesteld met een gouden standaard methode). We verwachten dus een positief testresultaat. Indien toch een negatief testresultaat wordt verkregen bij deze groep mensen dan wordt dit beschouwd als foutief negatief (in Engels False Negative afgekort met FN)

De specificiteit van een test is het percentage correct negatieve testresultaten (in Engels True Negative; TN) in een groep mensen waarvan is bewezen dat ze de ziekte niet hebben (met zekerheid vastgesteld met gouden standaard methode). We verwachten dus ook een negatief testresultaat. Indien toch een positief testresultaat wordt verkregen dan wordt dit beschouwd als foutief positief (in Engels False Positive afgekort met FP).

In een tabelvorm zou je dit als volgt kunnen weergeven:

	De ziekte COVID-19 (met gouden standaard bewezen)
Testresultaat	Aanwezig	Afwezig
Positief	TP	FP
Negatief	FN	TN
	Sensitiviteit = TP / (TP+FN)	Specificiteit = TN / (TN + FP)

 

Stel nu dat er een onderzoek is uitgevoerd in een groep patiënten opgenomen in het ziekenhuis waarbij met CT scan en klinisch beeld (gouden standaard) de ziekte COVID-19 is vastgesteld. Op het moment dat deze diagnose is gesteld is er sprake van ernstige ziekte activiteit, anders worden ze niet opgenomen in het ziekenhuis. In deze groep van 100 patiënten blijken (als voorbeeld) 99 een positief testresultaat (TP) en 1 een negatief resultaat (FN) te hebben. De sensitiviteit van deze test is 99% (99 / (99+1)).

Nu wordt dezelfde test gebruikt in een groep mensen die bij de huisarts komen met zeer milde klachten (geen koorts en alleen droge hoest en wat keelpijn). Van de 100 personen waarbij de test is uitgevoerd blijken er 20 een positief test resultaat te hebben (als voorbeeld). Ze worden geadviseerd om thuis is quarantaine te gaan vanwege de aanwezigheid van het corona-virus. Na enkele dagen komen 10 personen, die eerder negatief zijn getest, alsnog op de spoedeisende hulp van het ziekenhuis en blijken nu een corona infectie te hebben. Nu ze zieker zijn geworden blijkt de RNA test wel positief te zijn. Dit onderzoek suggereert dat er 10 personen zijn gemist (FN) en 20 correct zijn getest (TP) en de sensitiviteit van de test 67% is (20/(20+10).

De sensitiviteit van de test is dus gedaald van 99 naar 67% en blijkt dus afhankelijk van de onderzochte groep mensen of beter gezegd afhankelijk van de ernst van de ziekte van deze mensen. Als de virus-load maar hoog genoeg is zal de RNA test zeker een positief resultaat geven, maar als deze erg laag is (of zelfs afwezig op de plek waar het monster wordt genomen) kan het onder de kritische grens komen van meetbereik van de test. Deze kritische grens noemen we de onderste detectiegrens van een test. Er moeten (als voorbeeld) minstens 10 virusdeeltjes in een swab aanwezig zijn om een positief test resultaat te verkrijgen. Minder dan 10 geeft een negatief resultaat. Dit getal 10 heet ook de onderste detectiegrens van de test of de functionele sensitiviteit en wordt nogal eens verward met de klinische sensitiviteit zoals hierboven is beschreven.

De klinische sensitiviteit is dus niet alleen afhankelijk van de kwaliteit van de test (o.a. van de functionele sensitiviteit) maar ook van de ernst van de ziekte in de onderzochte populatie (of beter gezegd van de concentratie van de te onderzoeken stof in het monster). De keuze van een RNA of antigeen test voor het meten van virus RNA in een swab (slijm) is voor in het ziekenhuis opgenomen patiënten daarom een begrijpelijke keuze, maar voor willekeurige patiënten met milde of geen klachten in de algemene bevolking of bij zorgpersoneel is mijns inziens geen verstandige keuze.

Omdat de gebruikte PCR technieken heel specifiek alleen het RNA van het huidige COVID-19 virus kunnen detecteren is de specificiteit van deze RNA testen zeer hoog (bij benadering 100 %). Een positief resultaat zal zeer waarschijnlijk zijn toe te schrijven aan het corona virus. Het corona-virus uit de eerste uitbraak in China (SARS-Cov1 virus) heeft 75% identiek RNA dan het huidige virus, wat zeker niet genoeg om een positief resultaat te geven in de huidige SARS-Cov2 virus PCR testen.

 

Testen om een doorgemaakte ziekte aan te tonen

Na het doormaken van COVID-19 zullen de virus deeltjes snel verdwijnen als het herstel is ingetreden. Een RNA test levert dan natuurlijk geen bijdrage meer. Omdat het lichaam in staat is om door middel van een zeer ingenieus afweer systeem de virus deeltjes op te ruimen kunnen we gebruik maken van testen die de concentratie van virus-specifieke eiwitten meten van dit afweer systeem, de zogenaamde antistoffen, ook wel antilichamen genoemd.

Globaal is het afweer systeem in te delen in twee hoofdgroepen: 1. Het aspecifieke afweersysteem dat als eerste in actie komt bij een virus-aanval. We beschikken over cellen die bacteriën en virussen herkennen en opeten (fagocyteren), zoals granulocyten en monocyten. De capaciteit is echter beperkt en bij toename van het aantal virusdeeltjes na een aantal dagen zal dit systeem het niet aan kunnen. 2. Het specifieke afweersysteem komt als tweede in actie op verzoek van bovengenoemde fagocyten. We beschikken over B-lymfocyten die in staat zijn hele specifieke eiwitten aan te maken (antistoffen) die precies passen op de eiwitten van het virus, als een sleutel in en slot. In de eerste dagen, ongeveer 5 dagen na het ontstaan van de eerste klachten, begint de aanmaak van zogenaamde IgM antistoffen; we spreken dan van seroconversie. Dit zijn zeer grote eiwit moleculen die meerdere viruseiwitten (antigenen) tegelijk kunnen binden en als antistof-antigeen complex snel wordt herkend door de lever en worden afgebroken. Op deze manier kunnen snel grote hoeveelheden virusdeeltjes worden opgeruimd. Na ongeveer 10 dagen komt er een tweede afweersysteem in actie. Op basis van de kennis van de eiwit-structuur van de virus-eiwitten die in de afgelopen 10 dagen is opgebouwd in het lichaam, door hele specifieke lymfocyten, worden er nieuwe antistoffen gemaakt (IgG antistoffen) met een veel hogere mate van specificiteit en affiniteit tegen de virus-eiwitten. Dit proces heet klasse switch. Deze IgG sleutel past nog beter in het slot en valt er ook niet meer uit. Als het IgG antistof-antigeen complex is gevormd wordt het snel opgeruimd en afgebroken door diverse cellen in het lichaam.  De efficiency waarin dit systeem kan worden aangezet bepaald het verloop van de ziekte na ongeveer 10 dagen. De efficiency waarmee specifieke antistoffen tegen dit virus kunnen worden gemaakt is onder ander erfelijk bepaald (daarom komen er in sommige families meer ernstige ziekte voor dan in andere) en bepaald door de individuele gezondheidstoestand. Wanneer de kwaliteit van de antistoffen niet optimaal en de virusload hoog blijft, worden er vaak wel meer antistoffen gemaakt, maar is de uitkomst niet perse beter. Patiënten die op de IC zijn gekomen hebben doorgaans veel hogere IgG antistof titers.

Er is inmiddels bekend welke eiwitten het virus maakt (zie afbeelding bovenaan). Deze eiwitten worden door het virus gemaakt aan de hand van het virale RNA wat als matrijs functioneert. Het corona virus RNA heeft 30.000 letters en kan hier 29 eiwitten mee maken (het menselijk genoom heeft meer dan 3 biljoen letters). De eiwitten aan de buitenkant van het virus, de zogenaamde Spike eiwitten of S-proteins, zorgen voor een kroon-achtig uiterlijk, vandaar de naam ‘corona virus’. In de binnenkant van het virus deeltje zitten veel Nucleocapsid eiwitten of N-proteins, die het RNA beschermen. Daarnaast zijn er nog 27 andere geniepige eiwitten die het virus zo virulent maken.

We weten inmiddels dat bijna alle mensen IgM en IgG antistoffen maken tegen het S-eiwit en tegen het N-eiwit tijdens een corona infectie, maar niet allemaal in dezelfde mate, niet in dezelfde verhouding en ook niet in dezelfde snelheid. De aanmaak van IgM antistoffen begint ongeveer 5 dagen na het begin van de ziekteverschijnselen, maar bij sommige mensen begint dat pas na 8 dagen. Bij de één wordt vervolgens na een paar dagen al een maximale piek bereikt, terwijl de ander daar 14 dagen over doet. Dus ongeveer 14 dagen na het begin van de ziekte verschijnselen moet iedereen die geïnfecteerd is geweest met het virus IgM antistoffen hebben aangemaakt (meer dan 98% met bewezen virus infectie). Bij sommige mensen die geen klachten hebben gehad bestaat de kans dat het virus wel (kort) aanwezig is geweest, maar de concentratie antistoffen zeer laag is, onder de analytische detectiegrens van de test. Deze zullen we als negatief beoordelen, mogelijk onterecht (FN); maar mogelijk heeft het ook geen betekenis wat betreft immuniteit en is het wel terecht negatief (TN). Er zijn aanwijzingen dat bij een groot deel van deze groep de test na 3 weken alsnog postief wordt. Er is geen gouden standaard om definitief vast te stellen of er daadwerkelijk een virus infectie is geweest; formeel is de senstiviteit van een antistof test bij mensen zonder klachten dus niet te berekenen. Een kleine groep personen met onderliggende ziekte en/of gebruik van medicatie die het immuunsysteem negatief beïnvloeden (bijvoorbeeld corticosteroïden) kunnen zo weinig IgM antistoffen aanmaken dat het niet meetbaar is. Dit kan leiden tot fout negatieve resultaten. U voelt wel aan dat de maximale sensitiviteit van de IgM test hierdoor lager wordt. Het is nu dus duidelijk dat de sensitiviteit daalt naarmate er eerder in het ziekteproces wordt getest. De sensitiviteit voor de IgM test daalt van 95% (14 dagen na begin van klachten) naar ongeveer 30% (5 dagen na begin van klachten). Tussen ongeveer 14 dagen en 3 maanden na het begin van de klachten is de beste periode, daarna neemt de concentratie van de IgM antistoffen weer geleidelijk af. Maar als er geen klachten zijn geweest kunnen we deze timing niet gebruiken en moeten we er rekening houden dat een recente infectie (binnen de afgelopen 14 dagen) kan worden gemist.

Hetzelfde verhaal gaat op voor de IgG antistoffen. Deze komen echter nog wat later in actie en worden pas aangemaakt na ongeveer 8-10 dagen na het begin van de ziekte verschijnselen en bereikt een piek na ongeveer 4 weken. De IgG antistoffen dalen daarna nauwelijks meer, in tegenstelling tot IgM antistoffen, en zijn daarna nog lang aantoonbaar, waarschijnlijk langer dan een jaar. Deze IgG antistoffen vormen ook het geheugen van de COVID-19 ziekte. Als er voldoende IgG antistoffen aanwezig zijn van voldoende kwaliteit zal een volgende virus aanval effectief kunnen worden bestreden. Het lichaam zal dan direct vanuit de geheugen-cellen de juiste IgG antistoffen in grote hoeveelheid aanmaken, waardoor het virus geen kans krijgt om een ernstige infectie te veroorzaken. De meeste testen meten echter niet de exacte hoeveelheid en ook niet de affiniteit van de antistoffen, maar geven alleen de aan- of afwezigheid ervan aan (zogenaamde kwalitatieve testen). Maar in het algemeen kunnen we met redelijke zekerheid zeggen dat de aanwezigheid van IgG antistoffen bescherming geeft tegen een komende corona infectie; dit geldt niet als er alleen maar IgM en geen IgG antistoffen aantoonbaar zijn.

Evenals bij de IgM test neemt de sensitiviteit van de IgG test dus af naarmate we eerder testen in het ziektebeloop (als er al ziekteverschijnselen zijn geweest). Ongeveer 1 week na het begin van ziekteverschijnselen is de sensitiviteit van de IgG test 40 %, na 2 weken loopt het op naar 80% en na 3 weken naar 98%

De testen die zijn gebaseerd op het meten van IgG en IgM antistoffen, maken gebruik van gezuiverd recombinant viraal S-protein of N-protein om de antistoffen in het bloed mee te vangen. Deze eiwitten zijn in een test-cassette of een Elisaplaat aangebracht, via een coating proces, waar vervolgens het bloed mee in contact komt. Er vindt een sterke binding plaats tussen deze vastgeplakte virale eiwitten en de in het bloed aanwezige antistoffen. Dit complex kan worden gekleurd, waarmee de antistoffen aantoonbaar worden gemaakt. Sommige leveranciers maken gebruik van het S-protein en anderen van het N-protein en soms is dit niet bekend. Dit maakt dat niet elke test dezelfde uitslag zal laten zien. 

We onderscheiden twee type testen: in de laboratoria worden Elisa (of daar aan verwante) testen gebruikt en in uw praktijk maakt u gebruik van de zogenaamde point of care snel-testen (rapid tests). Beide zijn gebaseerd op dezelfde principes. Maar met de elisa testen worden tussentijds was-stappen uitgevoerd waardoor aspecifieke reactie worden verminderd. Hierdoor kunnen elisa testen lagere concentraties meten en iets eerder in het ziekteproces positieve IgM en IgG waarden meten dan de rapid-testen. Uiteindelijk zal na 3 weken de sensitiviteit tussen beide technieken net veel verschillen. Ook de rapid-test laten zien dat de sensitiviteit bij patiënten met bewezen corona (RNA test, CT scan en ziekenhuis opname gedurende van 3 weken) ongeveer 95-98% is.

De specificiteit van deze immunoassays liggen rond de 95-99%. Om dit vast te stellen is er gebruik gemaakt van serum van gezonde personen dat is afgenomen ruim vóór de corona crisis. Dat betekent dat als u geen corona virus infectie heeft doorgemaakt (met uitzondering van de afgelopen 3 weken en bij zeer lage titers) de test met meer dan 95% zekerheid ook negatief is. Dit geldt voor zowel de Elisa test als voor de sneltest (rapid-test) die wij beide gaan gebruiken.

Interpretatie van de antistof testen samengevat:

Status	IgM	IgG	Controle	Interpretatie
1	+	-	+	Recente primaire infectie (zeer waarschijnlijk in de afgelopen 14 dagen)
2	+	+	+	Infectie doorgemaakt met opgebouwde immuniteit. In hoeverre het volledige bescherming geeft is nog onzeker
3	-	+	+	Niet-recente infectie (langer dan 3 maanden geleden) en opgebouwde immuniteit. In hoeverre het volledige bescherming geeft is nog onzeker
4	-	-	+	Geen infectie doorgemaakt. Dit kan niet met zekerheid worden gezegd als de antistof titer te laag is en/of geen seroconversie heeft plaatsgevonden vanwege een infectie in de afgelopen 14 dagen. Bij verdenking van doorgemaakte infectie de test over 14 dagen herhalen (bij voorkeur met elisa methode)
5	+of-	+of-	-	Ongeldige test; niet te beoordelen.

 

Conclusie

In de literatuur worden nogal eens verschillende antistof testen met elkaar vergeleken met serum van patiënten die een recente infectie hebben doorgemaakt. En dan blijkt dat een elisa test een (iets) hogere sensitiviteit heeft dan een rapid test. Dit zal in de komende tijd door de media ongetwijfeld breed uit worden gemeten. Maar uit bovenstaande kunt u begrijpen dat dit soort onderzoek kritisch moet worden beschouwd. De sensitiviteit wordt minder bepaald door de kwaliteit van de test maar meer door het tijdstip wanneer de test wordt uitgevoerd.

Verder zullen de antistof testen, vooral de rapid-testen, door deskundingen op basis van senstiviteit in de toekomst worden afgekeurd, terwijl deze discussie voor de RNA testen op wanggslijm, met discutabele sensitiviteit (zie hierboven), nooit is gevoerd. Mogelijk spelen hier politieke en financiele belangen een rol.

Uiteraard kunnen er ook minder goede testen op de markt verschijnen. Wij hebben op basis van onze ervaring met leveranciers van dit soort kits twee geschikte testen geselecteerd; een Elisa test voor laboratorium gebruik (voor de home collect test) en een rapid-test voor ‘professional use only’ als point of care test. Na een interne positief afgeronde validatie kunnen we de testen gaan uitleveren. Beide testen hebben een CE/IVD certificaat en zijn toegelaten op de Europese markt. Er bestaan op dit moment nog geen goedgekeurde thuistesten voor de consument.